Se van a transformar bacterias de E. coli K-12, para ellos mediante un choque térmico se les va a introducir el plásmido pGLO.
Los estudiantes han realizan un sencillo procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en laoscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta. que contiene, además de la proteína GFP, el gen para la producción de betalactamasas, lo que hace a la bacteria portadora de este gen ser resistente a la ampicilina. Las betalactamasas son enzimas producidas y excretadas por las bacterias que contienen estos plásmidos. Las betalactamasas inactivan la ampicilina presente en el agar LB, permitiendo el crecimiento bacteriano. Únicamente las bacterias transformadas con el plásmido y que expresan las betalactamasas sobrevivirán en las placas que contienen ampicilina. Sólo un reducido porcentaje de células captan el plásmido. Las células que no se transforman no pueden crecer en las placas con ampicilina.
La expresión génica está estrechamente regulada en todos los organismos para permitir la
adaptación a diferentes condiciones y para evitar una superproducción de proteínas innecesarias. Los
genes implicados en la degradación de los diferentes nutrientes son un buen ejemplo de genes con
una alta regulación. Por ejemplo, la arabinosa es una fuente de energía y de carbono para la bacteria.
Los genes bacterianos que codifican las enzimas para degradar la arabinosa no se expresan cuando
no hay arabinosa en el medio. Pero cuando hay arabinosa, los genes se activan, volviéndose a
inactivar cuando se agota la arabinosa.
La arabinosa inicia la transcripción de estos genes induciendo la unión de la ARN polimerasa. En el
plásmido modificado genéticamente pGLO, algunos de los genes implicados en la degradación de la
arabinosa han sido sustituidos por los genes que en la medusa codifican la proteína GFP. Cuando las
bacterias transformadas con el plásmido pGLO están creciendo en presencia de arabinosa, el gen GFP
se activa y las bacterias emiten un color verde brillante cuando se exponen a luz ultravioleta.
En ausencia de arabinosa en el medio, el gen GFP permanece inactivado y las colonias bacterianas
son de color blanco.
Primer día.
Se comienza aprendiendo a pipetear con las pipetas pasteur:
Se revisan los protocolos:
Todo desinfectado y preparado:
Se comienza a preparar el LB Agar :
Para preparar el agar, añadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Añadir el
contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullición en
el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces más hasta que el agar se disuelva, teniendo
cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano.
Mientras tanto se prepara la Arabinosa, con la solución de transformación y la ampicilina, antibiótico necesraio para controlar si se ha producido la transformación, al igual que la arabinosa es necesaria para que se pueda expresar el gen que se va a transformar.
La arabinosa se prepara con una pipeta estéril, añade 3 ml de la solución de transformación en el vial para rehidratar el azúcar.
La ampicilina también está envasada en un pequeño vial y deshidratada. Con otra pipeta estéril,
añade 3 ml de la solución de transformación al vial para rehidratar el antibiótico (Se utiliza la solución de transformación porque está estéril)
Se preparan, para después echárselo al medio de cultivo:
Cuando el agar se haya disuelto, se dejar enfriar hasta que el matraz se pueda tocar sin quemarse (50
ºC).
Se termina de rotular las placas:
Se comienza a preparar las placas con LB- Agar:
Posteriormente se aporta el antibiótico. Comenzamos a echar el LB Agar/ampicilina:
Y por último se aporta la arabinosa, para preparar las placas LB-Agar/Ampicilina/ Arabinosa:
Todas las placas preparadas:
Y se guardan en la estufa para que solidifique el medio de cultivo:
2º Día
Ya tenemos las placas petri preparadas para sembrar. De manera que lo que hay que hacer es rehidratar E. coli que se encuentra liofilizada:
Con una pipeta estéril, rehidratar el liofilizado de E. coli HB101 añadiendo 250 ml de la solución de
transformación en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensión 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar el vial antes de añadirlo a las placas de LB.
Preparados para la rehidratación:
Una vez rehidratada E. coli, se siembran las placas por cuadrantes:
Las placas sembradas se incuban a 37 ºC:
El resto de las placas se recogen
Y se guardan en el frigorífico:
3º Día
Empezamos ensayando para coger el plásmido:
Se prepara para el choque térmico:
Vemos que nos han crecido E. coli, que se caracteriza por presentar colonias de color crema, redondas y de bordes lisos.
Prepración del plásmido:
Con una pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación en el vial que contiene el
plásmido pGLO liofilizado. La cantidad de ADN es tan pequeña que puede parecer que el vial está
vacío.
Todo listo para comenzar. Lo primero se añade 1 ml de la solución de transformación (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos eppendorf de 2 ml.
Etiquetamos los tubos eppendorf:
(+): con plásmido
(-): sin plásmido
Comprobamos si presenta fluorescencia el plásmido…
Todos listo!!!
Se introduce E. coli, en los dos tubos eppendorf:
Y posteriormente se coge el plásmido con el asa estéril y se coloca en el tubo eppendorf (+):
Choque térmico:
– Incubar los tubos en hielo 10 minutos.
– Llevar los tubos en la gradilla
al baño ya preparado a 42 ºC, e introducirlos
allí durante 50 segundos exactos.
Cuando se encuentra a la temperatura adecuada:
Se introduce durante 50 segundos:
Asegurándonos de que se encuentre los tubos en el agua caliente.
– Llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y
viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos.
Rotulamos las placas poniendo las (+) y (-)
Ya solo queda sembrar:
Todo listo!!! se meten en la estufa a 37º C y a esperar 24 horas:
Lo que nos debería salir:
Último día: Resultados
Se aprecia que han crecido muchas colonias de E. coli no transformadas en el medio de LB-Arabinosa:
En el medio del antibiótico, y que no ha sido transformadas no crece ninguna colonia
Y por último observamos que se han transformado las bacterias, ya que crecen en el medio con antibióticos. Pero para que se exprese el gen debe haber arabinosa en el medio
Se han celebrado las Olimpiadas de Geología (2019), en la que ha quedado ganadora la alumna del IES San Sebastían Martha Blanco, y entre los diez mejores Javier Pineda y Alba Camacho.
Entrega de diplomas:
En Huelva:
En Cáceres, donde se celebró la final:
Reconocimiento del Centro a los alumnos participantes en las Olimpiadas y a nuestra ganadora Martha Blanco.
Finalistas:
Javi
Alba
Y la ganadora: Martha
Todos los participantes:
Y con todos los posibles nuevos participantes para los próximos años:
Y nuestro fantástico curso de 1º de Bachillerato!!!
Científicos de Marismas del Odiel han impartido una conferencia de la presencia del Aguila Pescadora en las marismas del Odiel. En la que han explicado cómo han conseguido introducirla, después de que en los años 60 desapareciera del paraje.
Para tener más información de cómo se ha introducido el águila pescadora, mira los siguientes vídeos:
Se ha realizado una salida a Portugal para realizar estudios geológicos. Los alumnos que han realizado la práctica han sido de 2º de ESO y, tutorizados también, por 3 alumnos de 1º de Bachillerato que han ganado las Olimpiadas de Geología en Huelva (Febrero, 2019).
Las paradas se han realizado en la Playa de la Luz y la Playa de Salema.
Playa de la Luz:
Se ha realizado un recorrido, y se han visto distintos tipos de rocas.
Empezamos viendo rocas sedimentarias que se formaron hace 112 millones de año!!!
Utilizamos las brújulas para ver la orientación de los pliegues:
Se aprecian los estratos de las rocas sedimentarias:
También se aprecian fósiles de turritelas:
Continuamos la marcha:
Tenemos que llegar hasta el acantilado que se ve al final de la playa arenosa:
Continúan siendo rocas sedimentarias:
En la plataforma de abrasión se observan cantos que han sido erosionados por acción de las olas y corrientes.
Se vuelve a estudiar la dirección de los estratos:
En el acantilado se aprecia las diaclasas, que posteriormente caerán por acción del oleaje y formarán la plataforma de abrrsión.
En la plataforma encontramos basalto entre las rocas sedimentarias:
Esto quiere decir que cerca hubo un volcán!!! Así que continuamos la marcha:
Hasta que encontramos una brecha volcánica!!! Esto nos confirma que es una zona volcánica, que ha surgido después de las rocas sedimentarias.
Continuamos a la siguiente parada de la playa de Salema. Y también hay tiempo para estudiar organismos bentónicos que nos encontramos, como Astropecten sp., de manera que recordamos que pertenece al Filo de los Equinodermos y a la Clase de los Asteroideos.
Playa de Salema:
Por fin vemos las huellas de Dinosaurios!!!! Se han conservado en rocas sedimentarias
Por las huellas se sabe que era bípedo y de un tamaño considerable
Se ve claramente que estamos en rocas sedimentarias por los estratos que presentan.
También hay fósiles de grutas realizadas por anélidos gigantes:
Continuamos, después de comer, hasta el Cabo de San Vicente:
“En el IES San Sebastián se ha desarrollado, hoy 21 de Diciembre, en el marco del II Plan Estratégico de Igualdad del Centro, una actividad para visibilizar el papel de la mujer en el campo de la ciencia. La actividad fue promovida por el Departamento de Biología y Geología. Fue organizada por el alumnado de Cultura Científica de 1º de Bachillerato y participó todo el alumnado de 1º de Bachillerato (Ciencias, Ciencias Sociales y Humanidades). La actividad consistió en compartir un desayuno con varias mujeres que poseen una formación científica y desarrollan un trabajo vinculado al campo de la ciencia. Durante el mismo los alumnos y alumnas tuvieron la oportunidad de charlar sobre la experiencia de estas mujeres en su camino hacia sus actuales puestos de trabajo y de compartir inquietudes de los propios estudiantes en relación con este tema y con su propio futuro. También hubo un momento de revivir el papel de numerosas mujeres científicas, menos conocidas, en el desarrollo de distintas disciplinas.
Al término del desayuno, se eligieron los diseños ganadores de un concurso de “Diseño de Camisetas” en relación con la misma temática. Participaron como invitadas Carmen Moreno (Geóloga y profesora de Estratigrafía de la UHU), Mª Luisa Cordero (Bióloga y Directora del centro del IFAPA Punta Umbría), Reyes Sánchez (Ingeniera Industrial e Investigadora y profesora de la UHU), Esperanza Morillo (Química y Directora de Proyectos de Atlantic Copper), Beatriz Aranda (Ingeniera de Materiales y Vicerrectora de Ordenación Académica, Grado y Posgrado)”.
Invitadas:
– Reyes Sánchez (Ingeniera Industrial e Investigadora y profesora de la UHU) – Mª Luisa Cordero (Bióloga y
(Jefa de INFAPA, Aguas del Pino)
– Esperanza Morillo (Química y Directora de Proyectos de Atlantic Copper)
– Carmen Moreno (Geóloga y Profesora de Estratigrafía de UHU)
– Beatriz Aranda (Ingeniera de Materiales y Vicerrectora de Ordenación Académica, Grado y Posgrado)
Se comenzó con una serie de preguntas a las invitadas:
– Nombre de una científica favorita
– Hobby
– Libro favorito
– Cosas realizadas de las que se sienten orgullosas
– Anécdota relacionada con la ciencia y el género
– Utensilio de trabajo
Con estas preguntas se realiza un juego en el que los alumnos de 1º de Bachillerato deben relacionar a nuestras invitadas con su profesión.
A continuación se continúa con el café:
Las Científicas se sientan con nuestros alumnos:
Continuamos con el concurso de camisetas diseñadas por los alumnos:
Dos camisetas ganadoras:
El Director del Centro y el Vicedirector agraden a nuestras invitadas su presencia y la charla con nuestros alumnos
Visitamos las salinas del Astúr en el Paraje Natural de los Enebrales, donde se encuentra una empresa de Acuicultura en la que se cultivan doradas y lubinas de forma semi-intensiva. Los alumn@s realizan las tareas de un acuicultor.
Llegamos temprano y vamos a ver la flecha del Rompido:
Llegamos a las salinas:
y nos comentan las tareas que se van a realizar.
Comenzamos con una vuelta de reconocimiento por las balsas
La vegetación típica de salinas, la salicornia, que es comestible y tiene un agradable sabor a mar.
La zona del comedero presenta una malla para evitar la depredación por las aves.
Se levanta la nasa de muestreo
Ha cogido una dorada
La balsa está cubierta por cuerdas para evitar que las aves se coman a los alevines.
Continuamos con el muestreo, ahora se va a hacer con cañas de pescar. Nos enseñan a utilizar la caña.
Y a pescar:
Se pesca la primera dorada!!!!
Se continua con la pesca y se coge otra dorada:
Hay que continuar trabajando, se analiza el estado externo de la dorada
y se continua haciendo la disección para estudiar la anatomía interna. Primero, nos explican cómo hacerlo y se indica por donde hay que hacer la incisión:
Todos a trabajar…
El hígado es lo primero que vemos
El intestino:
Continuamos, ahora vemos el bazo:
El corazón:
Terminamos de sacar la mayoría de los órganos
La siguiente tarea es el estudio de parámetros físico-químicos del agua. Para ello se toman muestras de agua y se analiza el oxígeno en disolución y la temperatura.
Y después se filtra el agua para el estudio del plancton.
INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN Y FORMACIÓN AGRARIA Y PESQUERA
Con objetivo de contribuir a la modernización y mejora de la competitividad de los sectores pesquero y acuícola andaluz, el Centro desarrolla una importante labor de investigación y desarrollo tecnológico en el área de Cultivos marinos y recursos pesqueros.
RECORRIDO POR EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN
Recepción
Información del Centro:
La actividad se centra en las siguientes líneas de trabajo:
Acuicultura. En el año 2002 se iniciaron los primeros estudios sobre las posibilidades acuícolas de nuevas especies, desde entonces se ha consolidado el grupo de acuicultura de peces planos, obteniendo resultados prometedores en el cultivo de la acedía (Dicologoglossa cuneata). Igualmente se trabaja en el estudio de la reproducción y desarrollo larvario de cefalópodos, habiéndose establecido relaciones de colaboración con varias universidades con intereses similares.
Patología. Su actividad está asociada al área acuícola, abordando el estudio de las alteraciones patológicas relacionadas con los cultivos desarrollados en el centro.
Recursos marinos y procesos oceanográficos costeros. Su objetivo es conocer la dinámica oceanográfica y de las poblaciones marinas, con el fin de mejorar la gestión de las poblaciones naturales.
Determinación de la calidad de las aguas, con objeto de realizar el seguimiento de la calidad del agua utilizada en las actividades del centro.(www.juntadeandalucia.es/agriculturaypesca/ifapa/web/personas-estructuras-y-servicios/centros-ifapa/centro-ifapa-agua-del-pino)
Laboratorio de Patología
En el laboratorio nos enseñan las líneas de investigación:
– Mantenimiento en cautividad de la Nacra (Pinna nobilis)
– Cultivo de la almeja fina (Ruditapes decussata)
– Cangrejo parásito de bivalvos (Afropinnotheres monodi).
Explican los procedimientos de investigación:
Para la determinación de patógenos utilizan distintas técnicas como son los cultivos en placa petri con distintos medios, pruebas bioquímicas, estudios histológicos y biología molecular:
Laboratorio de algas
Explican el procedimiento del cultivo de las microalgas. Se aísla una especie concreta en un medio de agar en placas petris.
A continuación se pasa el cultivo a tubos de ensayos.
A partir de este cultivo, se siembra en erlenmeyer y matraces para pasar posteriormente a grandes bolsas.
El color indica la densidad de población de microalgas y por él, se determina cuando está listo para utilizarlo como alimento.
Para realizar el cultivo el agua debe ser estéril y hay que añadir los micronutrientes necesarios.
Tubos de ensayos y erlenmeyers preparados para sembrar:
Matraces y erlenmeyer sembrados, a partir de éstos se siembran las bolsas.
Sala de Bivalvos
Se cultivan almejas y ostras.
Se inicia con la inducción a la puesta, que se realiza normalmente, con un choque térmico, en el que se aumenta de 20º a 23-24ºC el agua donde se encuentran los reproductores. Con ésto se consigue que la hembra ponga los huevos y el macho expulse los espermatozoides y se produzca la fecundación en el medio.
Después de la fecundación, se recogen los huevos que inician el desarrollo de embrionario, y se recogen en estadio de larvas veliger que son plantónicas y se mantienen hasta las larvas D, en las que se cambian de contenedores ya que empieza la fijación al medio y pasan a ser bentónicas. A partir de aquí se consideran postlarvas. Y continúan el desarrollo hasta la fase de semillas, las cuales ya se podrían poner en el medio para las repoblaciones.
La alimentación se realiza con las microalgas cultivadas
Las etapas del cultivo mencionadas serían:
Primero la inducción a a puesta:
Segundo, recogida de los huevos y se mantienen hasta postlarvas:
A partir de las postlarvas, que ya presentan sifón en el caso de las almejas, se recogen las semillas
A medida que van creciendo las semillas se van desdoblando en los tanques de cultivos:
Taller de bivalvos
Se tratan los siguientes temas:
– Variabilidad de bivalvos
– Alimentación
– Distribución de bivalvos en el medio
– Estudio de la disposición de las valvas
Nos enseñan a distinguir las valvas derecha de la izquierda. Siempre la charnela hacia arriba. En el caso de la almeja hay que buscar la impresión de la cavidad paleal, y se coloca la salida de sifones hacia la zona posterior. En el caso del mejillón, hay que disponer el biso hacia abajo y también la marca del músculo aductor más posterior. Y en el caso de las ostras, que no tienen sifones ni biso, hay que fijarse en la impresión del músculo aductor.
– Anatomía de los bivalvos
Cultivo de peces
Se cultivan doradas, lubinas y lenguados.
Nos explican el cultivo de los peces, desde el mantenimiento los reproductores hasta la obtención de ejemplares que se pueden liberar al medio para las repoblaciones.
Nos cuentan que el mayor inconveniente del cultivo es el estrés que sufren los ejemplares en cautividad.
Taller de peces
Nos enseñan a hacer un muestreo.
Lo primero es anestesiar a los peces para poder trabajar con ellos. Una vez dormidos hay que tallarlos y pesarlos.
Una vez terminado se devuelven al tanque de recuperación.
Artes de pesca
Por último nos explican los artes de pesca, tanto de a pie como de embarcaciones
Lo primero que hemos tenido en cuenta ha sido el coeficiente de marea para planificar la salida, que la hemos realizado con los alumnos de 1º Bachillerato de Ciencias y los alumnos de 1º de ESO, que en los dos cursos, en el currículo incluye la biodiversidad de los seres vivos.
La idea es que los alumnos de 1º Bachillerato explique a los alumnos de 1º de ESO…
Comenzamos el estudio en el caño de aguas del pino del portil, y continuaremos hasta la desembocadura del Río Piedras.
Empezamos cogiendo muestras:
También se recogen ejemplares del Reino de los protoctistas (algas verdes, pardas y rojas):
En esta práctica, los estudiantes realizarán un procedimiento conocido como transformación
genética. La transformación genética ocurre cuando una célula capta y expresa una nueva porción de
material genético (ADN). Esta nueva información genética suele proporcionar al organismo una nueva
característica que es identificable después de la transformación. Transformación genética significa
literalmente cambio causado por genes, e implica la inserción de uno o más genes en un organismo,
con el objetivo de modificar las características de dicho organismo.
La transformación genética se usa en muchas áreas de la biotecnología.
El sistema pGLO
Con el kit de transformación pGLO, los estudiantes realizan un sencillo procedimiento para
transformar bacterias con un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green
Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea
victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en la
oscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la
proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta.
El plásmido pGLO de BioRad contiene el gen para la síntesis de la proteína GFP y un gen de
resistencia al antibiótico ampicilina. pGLO también contiene un sistema especial de regulación de
genes que se puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las células
transformadas. El gen para sintetizar GFP se puede activar en las células transformadas simplemente
añadiendo arabinosa al medio de cultivo. La selección de las células que se han transformado con el
plásmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibiótico. Las células
transformadas aparecerán blancas (fenotipo salvaje) en placas que no contengan arabinosa, y de color
verde fluorescente cuando se añada arabinosa al agar. La singular estructura de pGLO permite a profesores y estudiantes, por primera vez, estudiar fácilmente los mecanismos de la regulación génica
y la selección de genes. Y todo el proceso se puede observar con una simple lámpara de luz
ultravioleta.
Metodología:
– Preparación paso 1
1. Preparar el agar
Las placas se deben preparar al menos 3 días antes de realizar la práctica.
Se
deben almacenar 2 días a temperatura ambiental y luego bajo refrigeración hasta el momento de su
uso.
Para preparar el agar, añadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Añadir el
contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullición en
el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces más hasta que el agar se disuelva, teniendo
cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano.
Cuando el agar se haya disuelto, dejarlo enfriar hasta que el matraz se pueda tocar sin quemarse (50
ºC).
Mientras se enfría el agar, etiquetar las placas y preparar la arabinosa y la ampicilina. Tener cuidado de que el agar no se enfríe tanto que llegue a solidificar.
2. Preparar la arabinosa y la ampicilina
La arabinosa se encuentra deshidratada en un pequeño vial. Con una pipeta estéril, añade 3 ml de la
solución de transformación en el vial para rehidratar el azúcar. Agita el vial, mejor con la ayuda de un
vórtex. (Se utiliza la solución de transformación porque está estéril. En su lugar se puede utilizar agua
destilada estéril).
La ampicilina también está envasada en un pequeño vial y deshidratada. Con otra pipeta estéril,
añade 3 ml de la solución de transformación al vial para rehidratar el antibiótico (Se utiliza la solución
de transformación porque está estéril. En su lugar se puede utilizar
agua destilada estéril).
3. Rotular las placas
Las 40 placas de agar se deben rotular con un rotulador de tinta indeleble en la base, cerca del borde
de la placa.
Rotular 16 placas como LB, 16 como LB/amp y 8 como LB/amp/ara.
4. Añadir el agar LB en las placas
Primero, añadir el agar LB en las placas marcadas como LB. Hacer una torre de entre 4 y 8
placas y con una mano abrir la tapa de la placa inferior sujetando el resto de la torre, mientras que con
la otra mano se añade el agar LB.
Rellenar la placa entre un tercio y la mitad de su capacidad (»12 ml).
Tapar esa placa, y continuar con la placa superior en la torre. Cuando se hayan rellenado todas las
placas dejarlas enfriar en esa posición.
LB
A continuación, añadir la ampicilina ya hidratada al agar LB sobrante en el matraz. Agitar el
matraz brevemente para mezclarla. Rellenar las 16 placas rotuladas como LB/amp según la técnica descrita antes.
Por último, añadir la arabinosa hidratada al agar LB con ampicilina sobrante en el matraz.
Agitar el matraz brevemente para mezclarla y rellenar las 8 placas marcadas como LB/amp/ara
utilizando la técnica ya descrita.
Almacenar las placas
Después de dejar las placas dos días a temperatura ambiente se pueden utilizar o se pueden
almacenar en columnas de hasta 20 placas de altura introduciéndolas en bolsas. Guardar las placas en
la nevera de forma invertida y dentro de las bolsas hasta su uso.
– Preparación paso 2
1. Rehidratar las bacterias
Con una pipeta estéril, rehidratar el liofilizado de E. coli HB101 añadiendo 250 ml de la solución de
transformación en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensión 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar
el vial antes de añadirlo a las placas de LB. (Se utiliza la solución de transformación porque está estéril.
En su lugar se puede utilizar agua destilada estéril). Guardar la bacteria rehidratada en la nevera hasta
el momento de su uso (en 24 horas a ser posible, y no más de 3 días).
2. Sembrar las placas para obtener colonias bacterianas aisladas
Las placas de LB se deben sembrar para obtener
colonias aisladas de la bacteria y se deben incubar a 37 ºC durante 24-36 horas antes de la
transformación.
Partiendo de la suspensión de E. coli preparada en el punto 1 y de 8 placas LB, sembrar una placa
para cada uno de los grupos de estudiantes. El propósito del aislamiento es formar colonias aisladas a
partir de una suspensión con una alta concentración bacteriana.
a. Introducir el asa sin inclinar el
vial. Sacar el asa y extender en la placa como aparece en la figura inferior. La extensión se realiza
en cuatro cuadrantes. La primera extensión es para dispersar un poco las células. Deslizar el asa
de izquierda a derecha una docena de veces en cada uno de los cuadrantes. En cada cuadrante
consecutivo las células están cada vez más diluidas, aumentando la posibilidad de obtener
colonias aisladas.
b. Es importante utilizar la mayor superficie posible de placa para realizar la extensión. Girar la placa
45 grados aproximadamente (de manera que se facilite el movimiento de la mano) y comenzar con
el segundo cuadrante. Tocar el cuadrante anterior un par de veces y luego continuar deslizando el
asa de izquierda a derecha unas 10 veces.
c. Girar la placa de nuevo y repetir la acción.
d. Girar la placa por última vez y sembrar el último cuadrante. Repetir los pasos a-d en el resto de las
placas de LB. Usar el mismo asa de siembra para todas las placas. Al terminar con cada placa,
taparla inmediatamente para evitar su contaminación.
e. Dejar las placas toda la noche en posición invertida en la estufa a 37 ºC o a temperatura ambiente
durante 2-3 días si no se dispone de estufa. Usar para la transformación en las 24-36 horas
siguientes. No refrigerarlas antes de su uso.
f. E. coli produce colonias de color crema, redondas y de bordes lisos. No utilizar las placas
contaminadas con otras colonias.
3. Preparar el plásmido pGLO
Con una nueva pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación en el vial que contiene el
plásmido pGLO liofilizado. La cantidad de ADN es tan pequeña que puede parecer que el vial está
vacío. Si es posible, guardar el ADN rehidratado en la nevera (Se utiliza la solución de transformación
porque está estéril y no contienen nucleasas. En su lugar se puede utilizar agua destilada estéril).
– Preparación paso 3: Guía rápida para el uso del kit de transformación
1. Etiquetar los tubos eppendorf cerrados, uno
como +pGLO y otro como –pGLO. Poner los tubos
en una gradilla de corcho.
2. Abrir los tubos y con una pipeta estéril añadir
250 ml de la solución de transformación (CaCl2).
3. Poner los tubos en hielo.
4. Con un asa de siembra estéril coger una colonia
de la placa. Abrir el tubo +pGLO e introducir el
asa en la solución de transformación. Girar el
asa entre los dedos índice y pulgar hasta que la
colonia se disperse totalmente en la solución de
transformación (sin que queden fragmentos
flotantes). Dejar el tubo en la gradilla en hielo.
Con otro asa estéril repite la operación con el
tubo –pGLO.
5. Situar la solución con el plásmido pGLO a la luz
UV y anotar las observaciones. Introducir un
nuevo asa estéril en el vial que contiene el
plásmido y coger solución plasmídica (como si
cogiéramos jabón para hacer pompas de
jabón). Llevarlo al tubo +pGLO, cerrarlo y dejar
el tubo en la gradilla en el hielo. Cerrar también
el tubo –pGLO, pero sin añadir el plásmido.
¿Por qué? Plásmido ADN
6. Incubar los tubos en hielo 10 minutos.
Asegurarse de que el fondo de los tubos está
en contacto con el hielo.
7. Mientras que los tubos permanecen en el hielo,
etiquetar las placas de agar en la base de la
siguiente forma: una placa LB/amp y una
LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra
LB/amp/ara como –pGLO.
8. Choque térmico. Llevar los tubos en la gradilla
al baño ya preparado a 42 ºC, e introducirlos
allí durante 50 segundos exactos. Asegurarse
de colocar bien la gradilla para que el fondo de
los tubos esté en contacto con el agua.
Pasados los 50 segundos, llevar de nuevo los
tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y
viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los
tubos en el hielo 2 minutos.
9. Sacar la gradilla del hielo y dejarla en la mesa.
Abre uno de los tubos, y con una nueva pipeta
estéril, añade 250 ml de caldo LB al tubo y
ciérralo. Repetir la operación con otra pipeta
estéril en el otro tubo. Incubar los tubos 10
minutos a temperatura ambiente.
Caldo LB +pGLO – pGLO
10. Agitar los tubos golpeándolos con el dedo. Con
una pipeta estéril para cada tubo, pasar 100 ml
de cada tubo a las placas correspondientes.
11. Usando un asa de siembra estéril para cada
tubo, extender el líquido por toda la superficie
de la placa, haciendo estrías en el agar en
todos las direcciones.
12. Apilar las placas y empaquetarlas con cinta
adhesiva todas juntas. Poner el nombre del
grupo e introducirlas en posición invertida en la
estufa a 37 ºC hasta el día siguiente.
Resultados
A. Recogida de resultados
Observa los resultados obtenidos tras la transformación a la luz normal de la habitación. Después sitúa
las placas bajo luz ultravioleta y observa lo que ocurre.
1. Observa atentamente y dibuja lo que ves en cada placa. Pon tus dibujos en la tabla de resultados
en la columna de la derecha. Apunta los resultados para poder comparar las observaciones de las
células +pGLO con las observaciones de las células no transformadas.
Anota las siguientes observaciones para cada placa.
2. ¿Cuánto crecimiento se observa en cada placa, a simple vista?
3. ¿De qué color son las bacterias?
4. ¿Cuántas colonias bacterianas hay en cada placa? (Cuéntalas).
B: ¿Qué es lo que brilla?
Si se observa un color verde fluorescente en las colonias de E. coli, debemos plantear una nueva
pregunta:
¿Cuáles son las dos posibles fuentes de fluorescencia en las colonias cuando se exponen a
la luz ultravioleta?
Explica:
1. Recuerda qué observaste cuando iluminaste con luz ultravioleta el vial que contenía el plásmido
pGLO y anota tus observaciones.
2. ¿Cuál de las dos posibles fuentes de fluorescencia puede ser eliminada ahora?
3. ¿Qué indica esta observación sobre la fuente de fluorescencia?
4. Describe qué evidencias indican si la transformación genética se ha realizado con éxito o no.
C. Interacción entre los genes y el medio
Mira de nuevo tus cuatro placas. ¿Observas alguna colonia de E. coli en la placa LB que no
contenga ampicilina y arabinosa?
1. Basándote en tus resultados, ¿puedes decir si estas bacterias son resistentes a ampicilina
observándolas en la placa LB?
2. ¿Cómo modificarías el medio (el agar en el que están creciendo) para poder saber si son
resistentes a ampicilina?
3. Muy a menudo las características de un organismo se deben a la combinación de sus genes y del
medio.
Reflexiona sobre el color verde que viste en las bacterias transformadas:
a. ¿Qué dos factores ambientales deben estar presentes para que puedas ver el color verde? (Una
pista: un factor está en la placa y el otro en la forma cómo miras las bacterias).
b. ¿Cuál de los dos factores ambientales señalados en la pregunta anterior hacen a la bacteria
transformada que aparezca verde?
c. ¿Qué ventajas tendrá para un organismo el poder activar o desactivar determinados genes en
respuesta a diferentes condiciones?
D. Cálculo de la Tasa
de transformación
Tu próxima tarea es aprender a determinar hasta qué punto se ha producido la transformación de E.
coli, usando para ello una medida cuantitativa denominada tasa de transformación.
En muchos experimentos, es importante transformar la mayor cantidad posible de células.
La tasa de transformación se calcula para ayudar a los
científicos a determinar la eficacia del proceso de transformación.
Método: Tienes que calcular la tasa de transformación, la cual te indicará tu habilidad a la hora de introducir
moléculas de ADN en las células bacterianas.
La tasa de transformación es un número, que representa
el número total de células bacterianas que expresan la proteína GFP, entre la cantidad de ADN usada
en el experimento. Nos indica el número total de células bacterianas transformadas por microgramo de
ADN.
La tasa de transformación se calcula usando la siguiente fórmula:
Tasa de transformación = Número total de células que crecen en la placa / Cantidad de ADN (mg) en la placa
Por tanto, para poder calcular la tasa de transformación, necesitas saber:
1. El número total de colonias verde fluorescente que crecen en la placa LB/amp/ara.
2. La cantidad total de plásmido pGLO en las células bacterianas y presente en la placa
LB/amp/ara
Cálculos:
1. Determinación del número total de colonias verde fluorescente que crecen en la placa
LB/amp/ara.
Sitúa tu placa LB/amp/ara bajo luz UV.
Se supone que cada colonia de la placa procede de una
única célula, la cual, tras múltiples y sucesivas reproducciones, origina la colonia bacteriana.
La
manera más sencilla de determinar el número total de colonias verde fluorescente es contar las
colonias presentes en la placa.
Número total de células =
2. Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO en las células bacterianas y presente
en la placa LB/amp/ara.
Para determinar la cantidad de ADN del plásmido pGLO que hay en las células
bacterianas presentes en la placa LB/amp/ara necesitamos saber: (a) La cantidad de
ADN con la que empezamos el experimento, y (b) qué fracción del ADN (en la bacteria)
realmente se añadió a las placas de LB/amp/ara.
Una vez calculado estos dos factores, tendrás que multiplicar la cantidad total de plásmido
pGLO usada en el experimento por la fracción de ADN que aparece en las placas de LB/amp/ara.
(a) Determinación de la cantidad total de plásmido pGLO
La cantidad total de ADN utilizada inicialmente es igual al producto de la concentración y el
volumen utilizados:
ADN (mg) = Concentración ADN (mg/ml) x Volumen ADN (ml)
En este experimento utilizaste 10 ml de pGLO a la concentración de 0.08 mg/ml.
Es decir, que
cada microlitro de la solución contenía 0.08 mg del ADN plásmídico pGLO.
Calcula la cantidad total de ADN utilizada:
Cantidad total de ADN (mg) =
¿Para qué te sirve este dato?
(b) Determinación de la fracción de ADN realmente transferido a la placa de LB/amp/ara.
Dado que no todo el ADN añadido al cultivo bacteriano pasa a la placa de agar, necesitas saber
cuánto ADN pasó realmente a la placa LB/amp/ara. Para calcularlo, divide el volumen de ADN
que pusiste en la placa entre el volumen total que había en el tubo que contenía el ADN.
La
fórmula a utilizar sería:
Fracción ADN utilizada = Volumen en la placa (ml) / Volumen total tubo (ml)
Pasaste 100 ml de la solución de células que contenían el ADN, de un tubo con un volumen total
de 510 ml.
¿Recuerdas por qué contenía 510 ml? Consulta el protocolo, anota los volúmenes que
añadiste en cada paso y suma las cantidades.
Usa la siguiente fórmula para calcular la fracción de ADN plasmídico pGLO que pasó a la
placa LB/amp/ara.
Fracción de ADN =
¿Para qué te sirve este dato?
Por tanto, ¿cuántos microgramos de ADN del plásmido pGLO pasaste a las placas
LB/amp/ara?
Para contestar esta pregunta, debes multiplicar la cantidad total de ADN pGLO usada por la
fracción de ADN pGLO que pasó a la placa de LB/amp/ara:
ADN pGLO transferido (mg) = cantidad total de ADN pGLO usada (mg) x fracción de ADN pGLO
ADN pGLO (mg) =
¿Qué te dice este dato? Mira todos los cálculos hechos hasta ahora, y rellena la siguiente tabla:
Ahora usa los datos de la tabla para calcular la tasa de transformación:
Tasa de transformación = Nº total de células que crecen en la placa / Cantidad de ADN (mg) en la placa
Realizamos una salida a la zona Sur- Portuguesa. Nos acompañan
dos Doctores en Geología y Profesores de la Universidad
de Huelva, Francisco y Encarna.
Nos centramos en la zona de estudio: Monchique
Antes de comenzar el estudio, nos aportan la documentación necesaria para trabajar:
Y también nos enseñan el manejo de la brújula:
Y nos recuerdan que los estudios, siguiendo el método científico, hay que publicarlos:
COMENZAMOS EL ESTUDIO DE CAMPO:
1ª PARADA
Nos situamos en el mapa topográfico
comenzamos…
Un pliegue!!
Hay que estudiarlo:
Los pliegues son una deformación de la rocas, generalmente sedimentarias, en la que elementos de carácter horizontal, como los estratos o los planos de esquistosidad (en el caso de rocas metamórficas), quedan curvados formando ondulaciones alargadas y más o menos paralelas entre si:
Los pliegues se originan por esfuerzos de compresión sobre las rocas que no llegan a romperlas; en cambio, cuando sí lo hacen, se forman las fallas.
Orientación del pliegue.. hay que usar las brújulas
Ya podemos hacer la ficha, después de ver el tipo de roca:
La roca: Grauvaca, que es sedimentaria procedente de areniscas, ya que se ven los granos. Son del Carbonífero.
Comenzamos a hacer nuestro mapa geológico:
2ª PARADA (dinámica)
Comenzamos con el mismo tipo de roca, grauvacas, se continúa viendo los estratos:
Hay cambio en la roca, ahora son corneanas por metamorfimos de contacto de las grauvacas con una cámara volcánica. Se notas más duras por el calentamiento que han sufrido.
Continuamos en la parada 2, hasta que encontramos el contacto con la roca ígnea:
Hay que marcarlo en el mapa topográfico
Seguimos hasta llegar a la cámara:
Nos explican como podía ser la cámara:
Hay que ver que tipo de roca plutónica es, nos enseñan a clasificarla:
No `presenta cuarzo, por lo que ya sabemos que no puede ser granito.
Presenta feldespato y feldespatoide, por lo que es una Sienita.
Seguimos caminado en la parada 2, y continúa siendo todo sienita.
Lo marcamos en el mapa topográfico:
Y nos hacen un perfil:
3ª PARADA
Sigue siendo la misma roca, sienita
Lo marcamos en el mapa:
4ª PARADA
Es una cantera de sienita:
El tamaño de los feldespato es mayor, por lo que estuvo más tiempo a altas temperaturas, de manera que sería la zona más interna de la cámara.
Nos enseñan una intrusión en la sienita de una roca básica, también de origen volcánico, de gabro
Se puede apreciar de dos formas la intrusión, una totalmente recta, lo que indica que ya estaba fría la roca; y la otra difuminada, lo que indica que la sienita aún estaba a altas temperatura.
También se aprecia la diferencia del tamaño del grano en el gabro, la zona más pegada a la sienita, que estaba fría, hace que se enfríe rápidamente el gabro y los cristales son más pequeños, mientras que a medida que nos alejamos del borde, los cristales son mayores.
También se aprecian enclaves de restos de sienita dentro del gabro.
Por las intrusiones también se puede calcular el buzamiento:
5ª PARADA
Estamos cerca de la segunda parada, se aprecia que la roca también es sienita.
Es un mirador, donde se puede apreciar todo el recorrido que hemos realizado
Hay que recopilar los datos
Desde esta vista, recordamos todas las paradas:
Nos hacen un corte de todo lo que hemos visto:
En la vista se aprecia el corte que nos han realizado, apreciándose como era la bóveda de la cámara magmática:
Y nuestro mapa geológico queda de la siguiente manera:
marrón: Grauvaca (sedimentaria)
amarillo: Corneanas (metamórfica de contacto)
rosa: Sienita (plutónica)
Un rato de relax, antes de marcharnos:
Y después de un día duro de trabajo, volvemos a España!!!!
Los estudiantes han realizan un sencillo procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en laoscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta. que contiene, además de la proteína GFP, el gen para la producción de betalactamasas, lo que hace a la bacteria portadora de este gen ser resistente a la ampicilina. Las betalactamasas son enzimas producidas y excretadas por las bacterias que contienen estos plásmidos. Las betalactamasas inactivan la ampicilina presente en el agar LB, permitiendo el crecimiento bacteriano. Únicamente las bacterias transformadas con el plásmido y que expresan las betalactamasas sobrevivirán en las placas que contienen ampicilina. Sólo un reducido porcentaje de células captan el plásmido. Las células que no se transforman no pueden crecer en las placas con ampicilina.
