Primer día.
Se revisan los protocolos:
Se comienza a preparar el LB Agar :
Para preparar el agar, añadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Añadir el
contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullición en
el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces más hasta que el agar se disuelva, teniendo
cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano.
Mientras tanto se prepara la Arabinosa, con la solución de transformación y la ampicilina, antibiótico necesraio para controlar si se ha producido la transformación, al igual que la arabinosa es necesaria para que se pueda expresar el gen que se va a transformar.
La arabinosa se prepara con una pipeta estéril, añade 3 ml de la solución de transformación en el vial para rehidratar el azúcar.
La ampicilina también está envasada en un pequeño vial y deshidratada. Con otra pipeta estéril,
añade 3 ml de la solución de transformación al vial para rehidratar el antibiótico (Se utiliza la solución de transformación porque está estéril)
Es hora de rotular las placas:
– LB Agar (-)
– LB Agar/ ampicilina (-)
– LB Agar/ ampicilina (+)
– LB Agar/ ampicilina/ arabinosa (+)
El agar está apunto:
Cuando el agar se haya disuelto, se dejar enfriar hasta que el matraz se pueda tocar sin quemarse (50
ºC).
Se termina de rotular las placas:
Se comienza a preparar las placas con LB- Agar:
Posteriormente se aporta el antibiótico. Comenzamos a echar el LB Agar/ampicilina:
Y por último se aporta la arabinosa, para preparar las placas LB-Agar/Ampicilina/ Arabinosa:
2º Día
Una vez rehidratada E. coli, se siembran las placas por cuadrantes:
El resto de las placas se recogen
Y se guardan en el frigorífico:
3º Día
Se prepara para el choque térmico:
Vemos que nos han crecido E. coli, que se caracteriza por presentar colonias de color crema, redondas y de bordes lisos.
Prepración del plásmido:
Con una pipeta estéril añadir 250 ml de la solución de transformación en el vial que contiene el
plásmido pGLO liofilizado. La cantidad de ADN es tan pequeña que puede parecer que el vial está
vacío.
Todo listo para comenzar. Lo primero se añade 1 ml de la solución de transformación (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos eppendorf de 2 ml.
Etiquetamos los tubos eppendorf:
(+): con plásmido
(-): sin plásmido
Comprobamos si presenta fluorescencia el plásmido…
Se introduce E. coli, en los dos tubos eppendorf:
Y posteriormente se coge el plásmido con el asa estéril y se coloca en el tubo eppendorf (+):
Choque térmico:
– Incubar los tubos en hielo 10 minutos.
– Llevar los tubos en la gradilla
al baño ya preparado a 42 ºC, e introducirlos
allí durante 50 segundos exactos.
Cuando se encuentra a la temperatura adecuada:
Se introduce durante 50 segundos:
Asegurándonos de que se encuentre los tubos en el agua caliente.
– Llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y
viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos.
Rotulamos las placas poniendo las (+) y (-)
Lo que nos debería salir:
Último día: Resultados
Se aprecia que han crecido muchas colonias de E. coli no transformadas en el medio de LB-Arabinosa:
En el medio del antibiótico, y que no ha sido transformadas no crece ninguna colonia
Y por último observamos que se han transformado las bacterias, ya que crecen en el medio con antibióticos. Pero para que se exprese el gen debe haber arabinosa en el medio
Ahora toca contar y estudiar los resultados
Vídeos realizados por los alumnos: