{"id":2184,"date":"2019-05-07T15:04:00","date_gmt":"2019-05-07T15:04:00","guid":{"rendered":"http:\/\/ka120-121.iessansebastian.com\/index.php\/2019\/05\/07\/transformacion-pglo\/"},"modified":"2019-05-07T15:04:00","modified_gmt":"2019-05-07T15:04:00","slug":"transformacion-pglo","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/ka120-121.iessansebastian.com\/index.php\/2019\/05\/07\/transformacion-pglo\/","title":{"rendered":"Transformaci\u00f3n pGLO"},"content":{"rendered":"
\nMayo 2019<\/div>\n
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\nSe van a transformar bacterias de E. coli K-12, para ellos mediante un choque t\u00e9rmico se les va a introducir el  pl\u00e1smido pGLO.<\/div>\n
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\n<\/a>Los estudiantes han  realizan un sencillo procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la s\u00edntesis de una prote\u00edna denominada GFP (Green Fluorescent Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia en laoscuridad. Despu\u00e9s de la transformaci\u00f3n, las bacterias expresan el gen de la medusa y sintetizan la prote\u00edna, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando son expuestas a luz ultravioleta. que contiene, adem\u00e1s de la prote\u00edna GFP, el gen para la producci\u00f3n de betalactamasas, lo que hace a la bacteria portadora de este gen ser resistente a la ampicilina. Las betalactamasas son enzimas producidas y excretadas por las bacterias que contienen estos pl\u00e1smidos. Las betalactamasas inactivan la ampicilina presente en el agar LB, permitiendo el crecimiento bacteriano. \u00danicamente las bacterias transformadas con el pl\u00e1smido y que expresan las betalactamasas sobrevivir\u00e1n en las placas que contienen ampicilina. S\u00f3lo un reducido porcentaje de c\u00e9lulas captan el pl\u00e1smido. Las c\u00e9lulas que no se transforman no pueden crecer en las placas con ampicilina.<\/div>\n
\nLa expresi\u00f3n g\u00e9nica est\u00e1 estrechamente regulada en todos los organismos para permitir la<\/div>\n
\nadaptaci\u00f3n a diferentes condiciones y para evitar una superproducci\u00f3n de prote\u00ednas innecesarias. Los<\/div>\n
\ngenes implicados en la degradaci\u00f3n de los diferentes nutrientes son un buen ejemplo de genes con<\/div>\n
\nuna alta regulaci\u00f3n. Por ejemplo, la arabinosa es una fuente de energ\u00eda y de carbono para la bacteria.<\/div>\n
\nLos genes bacterianos que codifican las enzimas para degradar la arabinosa no se expresan cuando<\/div>\n
\nno hay arabinosa en el medio. Pero cuando hay arabinosa, los genes se activan, volvi\u00e9ndose a<\/div>\n
\ninactivar cuando se agota la arabinosa.<\/div>\n
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\nLa arabinosa inicia la transcripci\u00f3n de estos genes induciendo la uni\u00f3n de la ARN polimerasa. En el<\/div>\n
\npl\u00e1smido modificado gen\u00e9ticamente pGLO, algunos de los genes implicados en la degradaci\u00f3n de la<\/div>\n
\narabinosa han sido sustituidos por los genes que en la medusa codifican la prote\u00edna GFP. Cuando las<\/div>\n
\nbacterias transformadas con el pl\u00e1smido pGLO est\u00e1n creciendo en presencia de arabinosa, el gen GFP<\/div>\n
\nse activa y las bacterias emiten un color verde brillante cuando se exponen a luz ultravioleta.<\/div>\n
\nEn ausencia de arabinosa en el medio, el gen GFP permanece inactivado y las colonias bacterianas<\/div>\n
\nson de color blanco.<\/div>\n
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\nPrimer d\u00eda.<\/b><\/h3>\n
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\nSe comienza aprendiendo a pipetear con las pipetas pasteur:<\/div>\n
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Se revisan los protocolos:<\/p>\n

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\nTodo desinfectado y preparado:<\/div>\n
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Se comienza a preparar el LB Agar :<\/p>\n

Para preparar el agar, a\u00f1adir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. A\u00f1adir el
\ncontenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullici\u00f3n en
\nel microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces m\u00e1s hasta que el agar se disuelva, teniendo
\ncuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano.<\/p>\n

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Mientras tanto se prepara la Arabinosa, con la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n y la ampicilina, antibi\u00f3tico necesraio para controlar si se ha producido la transformaci\u00f3n, al igual que la arabinosa es necesaria para que se pueda expresar el gen que se va a transformar.<\/p>\n

 La  arabinosa se prepara con una pipeta est\u00e9ril, a\u00f1ade 3 ml de la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n en el vial para rehidratar el az\u00facar.<\/p>\n

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La ampicilina tambi\u00e9n est\u00e1 envasada en un peque\u00f1o vial y deshidratada. Con otra pipeta est\u00e9ril,
\na\u00f1ade 3 ml de la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n al vial para rehidratar el antibi\u00f3tico (Se utiliza la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n porque est\u00e1 est\u00e9ril)<\/p>\n

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\nSe preparan, para despu\u00e9s ech\u00e1rselo al medio de cultivo:<\/div>\n

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Es hora de rotular las placas:<\/p>\n

– LB Agar (-)
\n– LB Agar\/ ampicilina (-)
\n– LB Agar\/ ampicilina (+)
\n– LB Agar\/ ampicilina\/ arabinosa (+)<\/p>\n

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El agar est\u00e1 apunto:<\/p>\n

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Cuando el agar se haya disuelto, se dejar enfriar hasta que el matraz se pueda tocar sin quemarse (50
\n\u00baC).<\/p>\n

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Se termina de rotular las placas:<\/p>\n

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Se comienza  a preparar las placas con LB- Agar:<\/p>\n

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\nPosteriormente se aporta el antibi\u00f3tico.  Comenzamos a echar el LB Agar\/ampicilina:<\/p>\n

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\nY por \u00faltimo se aporta la arabinosa, para preparar las placas LB-Agar\/Ampicilina\/ Arabinosa:<\/p>\n

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\nTodas las placas preparadas:<\/div>\n
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\nY se guardan en la estufa para que solidifique el medio de cultivo:<\/div>\n
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\n2\u00ba D\u00eda<\/b><\/h3>\n

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\nYa tenemos las placas petri preparadas para sembrar. De manera que lo que hay que hacer es rehidratar E. coli que se encuentra liofilizada:<\/div>\n
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\nCon una pipeta est\u00e9ril, rehidratar el liofilizado de E. coli HB101 a\u00f1adiendo 250 ml de la soluci\u00f3n de<\/div>\n
\ntransformaci\u00f3n en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensi\u00f3n 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar el vial antes de a\u00f1adirlo a las placas de LB.<\/div>\n
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\nPreparados para la rehidrataci\u00f3n:<\/div>\n

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Una vez rehidratada E. coli, se siembran las placas por cuadrantes:<\/p>\n

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\nLas placas sembradas se incuban a 37 \u00baC:<\/div>\n

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El resto de las placas se recogen<\/p>\n

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\nY se guardan en el frigor\u00edfico:<\/p>\n

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\n3\u00ba D\u00eda<\/b><\/h3>\n
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\nEmpezamos ensayando para coger el pl\u00e1smido:<\/div>\n
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Se prepara para el choque t\u00e9rmico:<\/p>\n

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\nVemos que nos han crecido E. coli, que se caracteriza por presentar colonias de color crema, redondas y de bordes lisos.<\/p>\n

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Prepraci\u00f3n del pl\u00e1smido:
\nCon una pipeta est\u00e9ril a\u00f1adir 250 ml de la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n en el vial que contiene el
\npl\u00e1smido pGLO liofilizado. La cantidad de ADN es tan peque\u00f1a que puede parecer que el vial est\u00e1
\nvac\u00edo.<\/p>\n

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Todo listo para comenzar. Lo primero  se a\u00f1ade 1 ml de la soluci\u00f3n de transformaci\u00f3n (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos eppendorf de 2 ml.<\/p>\n

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Etiquetamos los tubos  eppendorf:<\/p>\n

(+): con pl\u00e1smido
\n(-): sin pl\u00e1smido<\/p>\n

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\nComprobamos si presenta fluorescencia el pl\u00e1smido…<\/p>\n

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\nTodos listo!!!<\/div>\n

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\nSe introduce  E. coli, en los dos tubos eppendorf:<\/p>\n

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Y posteriormente se coge el pl\u00e1smido con el asa est\u00e9ril y se coloca en el tubo eppendorf (+):<\/p>\n

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Choque t\u00e9rmico:
\n– Incubar los tubos en hielo 10 minutos.<\/p>\n

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– Llevar los tubos en la gradilla
\nal ba\u00f1o ya preparado a 42 \u00baC, e introducirlos
\nall\u00ed durante 50 segundos exactos.<\/p>\n

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\nCuando se encuentra a la temperatura adecuada:<\/p>\n

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\nSe introduce durante 50 segundos:<\/p>\n

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\nAsegur\u00e1ndonos de que se encuentre los tubos en el agua caliente.<\/p>\n

– Llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al ba\u00f1o y
\nviceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos.<\/p>\n

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\nRotulamos las placas poniendo las (+) y (-)<\/p>\n

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\nYa solo queda sembrar:<\/div>\n
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\nTodo listo!!! se meten en la estufa a 37\u00ba C y a esperar 24 horas:<\/div>\n
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Lo que nos deber\u00eda salir:<\/p>\n

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\n\u00daltimo d\u00eda: Resultados<\/b><\/h3>\n
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 Se aprecia que han crecido muchas colonias de E. coli no transformadas en el medio de LB-Arabinosa:<\/p>\n

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 En el medio del antibi\u00f3tico, y que no ha sido transformadas no crece ninguna colonia<\/p>\n

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 Y por \u00faltimo observamos que se han transformado las bacterias, ya que crecen en el medio con antibi\u00f3ticos. Pero para que se exprese el gen debe haber arabinosa en el medio<\/p>\n

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Ahora toca contar y estudiar los resultados<\/p>\n

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V\u00eddeos realizados por los alumnos:<\/p>\n

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